Center of Log-cultivated Ganderma Research & Development       Fujian Academy of Agricultural Sciences  

  Center of  Medicinal  Mushroomt  Research & Developmen, of  APEMTC

灵芝属Ganoderma的分子生物学鉴定系统

许瑞祥 博士

（Agricultural Chemistry Department, National Taiwan University）

 一、核糖体RNA基因核苷酸序列分析

       80年代开始的分子生物学为物种分类开辟了一个新途径。目前常用核糖体RNA基因（ribosomal RNA gene）作为分子生物学分类的指标，这是由于其复制数目很高，并巳每一单位的r-RNA基因均具有保留区(conserved region)和可变区(variable region)搀杂分布。在探讨高级分类关系时，保留区的核苷酸序列具有辨别科或属的专一功能，而可变区的核着酸序列则有助于种间的区别。 1985年用聚合酶链反应(Polymerase chain action；PCR)大量复制特定片段DNA的方法问世后，利用特殊引物(primer)来扩增微量模版的DNA成为大量复制的DNA片段后，再利用rRNA基因来比较标本或菌株间的亲源关系，则克服了从前两者无法互相验证的困难，为真菌分类与种源探讨开辟了另一个新领域。

从1990年起，台湾大学许瑞祥等开始建立以基因资料进行灵芝属菌种分类的模式。并相继完成有关灵芝属菌丝体中全基因的分离纯化技术、聚合酶链反应扩增特定基因区域的操作条件、核苷酸序列分析资料的统计与演化程序的模拟计算等配套工作。目前已完成分析超过100株灵芝属菌种和标本的核糖体RNA基因核苷酸序列，其中部分经定序确认并已登录于欧洲分子生物学实验室（European Molecular Biology Laboratory，EMBL）的基因资料库中，并在国际资料网络中供各国研究人员查询。200多份灵芝属菌株的核糖体RNA基因资料经电脑程序演算分析后，确定可以根据其中25s rDNA中 D2区域核苷酸序列间的差异性区分灵芝属与非灵芝属，由图l结果可见25s rDNA中D2区域可有效的鉴别灵芝属与假芝属（Amauroderma）。同时发现在核糖体RNA基因中包含两段转录间隔区（internal transcribed  spaces, ITS）如图2所示。目前的结果显示ITS1及ITS2的核苷酸序列可以鉴别灵芝属中个别的种，灵芝属中种间的差异性可以利用ITS1和ITS2核苷酸序列作客观的判断。

为确认灵芝属中代表种灵芝G．lucidum物种与学名间的一致性，我们收集了各国的灵芝G．lucidum菌株和标本，并参考Steyaert，Ryvarden，Gilbertson和Wright等人对灵芝复合种G．lucidum complex的概念，将形态相近的拟热带灵芝G．ahmadii、G．carnosurn、松杉树芝G．tsugae、紫光灵芝G. valesiacum、G．oregonense、G．oerstedii、狭长孢灵芝G．boninense、无柄灵芝G. resinaceum和G．preifferi等菌株共同进行分析比较。将核糖体RNA基因中 D2和 ITS区域中的核苷酸序列经电脑程序分析后，配合传统形态，生理与交配试验的结果整理如图3所示。结果显示29株样品可以明确区分为6组，在各组间的菌种其ITS区域核苷酸序列的差异性在0％－2％之间，并具有相似的生理与形态特征，故位于同组间的分类地位应可视为同种。由图3检视第一组中，美国地区所采集的灵芝G. lucidum菌株46 755号和巴基斯坦所采集的拟热带灵芝G．ahmadii、欧洲地区所采集的紫光灵芝G．valesiacurn与G．carnosum、中国地区所采集的松杉树芝G．tsugae与G．oregonense等就其核糖体RNA基因的分析结果显示它们是亲源关系最为相近的一群，但其中却包含了6种不同的学名。第2组中，欧洲地区所分离的灵芝G．lucidum菌株与挪威采集的标本与法国、阿根廷所采集命名的G．oerstedii、中国的松杉树芝G．tsugae最为相似。第3组中，从台湾、印度、菲律宾等地区分离培养的灵芝G．lucidum菌株则与阿根廷的G．resinaceum相近。第4组显示，在台湾、日本等地常见的栽培种松杉树芝G．tsugae与中国大陆的灵芝G．lucidum 60537号菌株相似。第5组中，美国地区分离的灵芝 G．lucidum 430.84菌株与台湾地区的狭长抱灵芝G．boninense最相似。第6组中可见，在欧洲地区采集的G. recinacum和G．pferffeii可能是同种。

        从图3中可见每一组中学名混杂的情况，在欧洲、北美洲、南美洲和亚洲地区采集的灵芝G．lucidum被分别列于不同的组中。除了核糖体RNA基因ITS区域中核苷酸序列上的差异性外，其生理与形态上亦具明显的不同，这些均支持它们属于不同种。在松杉树芝G．tsugae菌株间亦出现同名异物的情形，可见所谓红色的灵芝无论是灵芝G．lucidum或松杉树芝G．tsugae，在不同的国家或地区里，同一学名所指的可能并不是相同的种。因此在文献中有关灵芝G．lucidum的复杂成分与多种功效是否仅为一种灵芝所具有便值得深思了。采用灵芝属内各种间的分子水平鉴定系统后，由于同种菌株的核糖体RNA基因中D2和ITS区域的核昔酸序列几乎完全相同，因此无法辨认同种间不同品系的菌株。为寻找品种间遗传组成的差异，许瑞祥等（199，199）利用随机扩增基因的多型性图谱来比较各品种间全基因组成上的特性。随机扩增基因（Random Amplified polymorphic DNA；RAPD）是聚合酶链反应技术的应用，原理是以任意一小段核苷酸序列当作引物（primer），在退火(annealing)温度，即 37℃左右之低温作用下，对全基因进行聚合酶链反应。由于是以全基因为模版，因此扩增所得的全基因多型性图谱相当于生物的指纹图（finger printing），可被用于同种间不同品种鉴定的依据。我们利用5组引物进行聚合酶链反应所得的多型性图谱可区分图4中无法区别的同种菌株，进一步标记出各品种间的距离（见图5）。结果显示，以核糖体RNA基因核着酸序列相似所归纳的同种菌株间，可以利用随机扩增全基因的多型性图谱进行个别品种的标示。以分子生物学技术探讨灵芝属内异种间或同种内的分类模式有助于解决以前命名的混淆以及文献中研究成果间的矛盾现象。

二、Mn-SOD基因核苷酸序列分析

许瑞祥等（199）对灵芝属菌株培养液中超氧化物歧化酶（super-oxide dismutase，SOD）的活性分析结果证明，灵芝属菌株的超氧化物歧化酶活性较一般真菌为高。为此，我们探讨了灵芝属来源的超氧歧化酶基因组成的特性，并于1996年完成第一条担子菌纲的Mn-SOD基因核着酸序列（基因资料库登录号码 u 56127），根据此序列设计引物进行灵芝属菌株Mn-SOD基因扩增反应。预计的聚合酶链反应产物约为426bp，但实际所获产物介于692bp至900bp之间，经测序分析所得的基因确实为Mn-SOD，并发现含有2段内含子（intron），其中内含子Ⅰ的长度介于65－103个核苷酸之间，而内含子Ⅱ的长度为 181－284个核苷酸。虽然在30株不同菌株间的内含子长度有差异，但是其插人的位置完全相同。分析各菌株Mn-SOD基因中表达序列（exon）部分时，显示在不同菌株间其表达序列的相似性高，长度皆为426个核苷酸，可以衍生出142个氨基酸，并已包括Mn-SOD几个重要的氨基酸。比较表达序列的长度可见，Mn-SOD基因中的两段非表达的内含子在不同菌株间其差异性极为显著，将此Mn-SOD基因核苷酸序列经PAUP（phylogenetic analysis using pasimony）程序统计分析的结果示于图6。图中数字所表示核苷酸位置的区别，结果显示，在Mn-SOD基因中包含区别灵芝属、种与品种的个别核苷酸序列。同时将Mn-SOD基因分析所得的系统演化关系图与前述核糖体RNA基因分析所得的结果进行比较，结果如图7所示。图7中右侧为核糖体RNA基因分析所得的演化关系，如前所述其鉴别能力仅能达到同种的范围，但左侧经Mn-SOD基因分析所获结果中，不但能区别种间的差异，而且亦能进一步区分同种菌株间彼此的亲疏关系。因此无论以核糖体RNA基因或是以Mn-SOD基因所建立的分类系统均显示灵芝属中具有与假芝属（Amaruroderma）及拟层孔菌属（Formitopsis）等明显不同的核苷酸序列保留区。在核糖体RNA基因中，由于其复制的数目较多，因此单一核苷酸突变时不容易被发现。然而在Mn-SOD基因中，复制数目较少，在不影响正常生理功能时，Mn-SOD基因中部分核苷酸序列的改变，相对的较容易被保留下来，能较真实的记录灵芝属中各菌种的演化历史。许瑞祥的实验结果指出在灵芝属分子生物学分类指标的选择上，Mn-SOD基因会比一般常用的核糖体RNA基因更为合适。Mn-SOD基因核苷酸序列可同时作为不同分类层次（taxonomic levels）的分类指标，即灵芝属与非灵芝属间。灵芝属内异种间与灵芝属同种但不同品系间分类的指标。在一般真菌类的基因中，由于其内含子的核苷酸序列变异太大而很少被用于分类指标。但灵芝属Mn-SOD基因中的内含子则可作为灵芝属系统演化的指标，并据此推测灵芝属是较晚形成的新物种。

千万年来灵芝一直与人类共存于世，扮演生态环境中分解者的角色。它可分解植物残体中的纤维素和木质素，促进碳元素循环。虽然在过去百年间，东西方科学家以严谨的态度研究灵芝，却因分类指标不够明确，在不断累积的文献中忽略了彼此使用材料的差异，因而影响了对研究结果的综合整理和评价。现代生物科技与分子生物学技术相结合进行的灵芝系统化研究，首先针对各国最普遍使用的灵芝G．lucidum菌株间种源的差异，提供了具体可行的鉴定模式。利用特定区域的核糖体 RNA基因和 Mn-SOD基因核着酸序列分析建立的灵芝属分子生物学鉴定系统，将有助于解决这些问题。将此鉴定系统应用于生产菌株的改良和筛选时，可作为确认菌种特性及其来源的稳定指标。也有助于改善灵芝产品的质量，促进灵芝产业的发展。

 Chen Tiqiang    ctqlz@fjlz.org      086-591-7572341